定量逆轉錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是應用于以RNA作為起始材料的PCR實驗中的一種實 驗方法。在該方法中，總RNA或信使RNA（mRNA）首先通過逆轉錄酶轉錄成互補DNA（cDNA）。隨后，以cDNA為模板 進行qPCR反應。RT-qPCR已被用于多種分子生物學的應用中，其中包括基因表達分析、RNA干擾驗證、微陣列驗證、病原 體檢測、基因測試和疾病研究。
RT-qPCR的一步法與兩步法 RT-qPCR可通過一步法或兩步法來完成
（圖1、表1）。一步法RT-qPCR把逆轉錄與PCR擴增結合在一起，使逆轉錄酶與 DNA聚合酶在同一管內同樣緩沖液條件下完成反應。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物。在兩步法RT-qPCR中， 逆轉錄和PCR擴增過程是在兩個管中完成，使用不同的優化的緩沖液、反應條件、以及引物設計策略。
圖 1.一步法與兩步法RT-qPCR
表 1.一步法及兩步法RT-qPCR優缺點比較
RT-qPCR逆轉錄過程
總RNA與mRNA的選擇
在設計RT-qPCR實驗過程中，決定是否要使用總RNA或純化的mRNA作為模板進行逆轉錄十分重要。盡管mRNA可能能夠 提供略高的靈敏度，但總RNA仍經常使用。其原因是總RNA作為起始材料具有較mRNA更重要的優勢。首先，其過程需要較 少的純化步驟，這確保了更好的定量回收模板和更好的把結果標準化為起始的細胞數。其次，其避免了mRNA富集步驟，這 能夠避免由于不同mRNA的回收率不同而帶來的結果偏移的可能性。總的來說，由于在大多數的應用中，目標基因的相對定 量比檢測的絕對靈敏度更為重要，因此在大多數情況下，總RNA更適用1。
逆轉錄引物
在兩步法中，有三種不同的方法可用于引發cDNA反應：oligo(dT) 引物、隨機引物、或序列特異性引物（圖2，表2）。通常 情況下，是將 oligo(dT) 引物和隨機引物進行混合使用。這些引物退火至模板 mRNA 鏈，并提供給逆轉錄酶一個用于合成的 起點位置。
圖 2.兩步法 RT-qPCR 中四種逆轉錄引發方法。
表 2.RT-qPCR 的 cDNA 合成中的引物注意事項。結合使用隨機引物與錨定 oligo(dT) 引物可提高逆轉錄效率及 qPCR 的靈 敏度。
逆轉錄酶
逆轉錄酶 是利用 RNA 合成 DNA 的一種酶。一部分逆轉錄酶具有 RNA 酶活性，能夠在轉錄后降解 RNA-DNA 雜交鏈中的 RNA 鏈。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以獲得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆 轉錄酶和禽成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶。對于 RT-qPCR 來說，理想的情況下是選擇具有較高熱穩定性的逆轉錄酶，這樣 cDNA 的合成能夠在較高的溫度下進行，確保成功轉錄具有較高二級結構的 RNA，同時保持其在整個反應過程中的全部活 性，從而得到更高的 cDNA 產量。
逆轉錄酶的 RNase H 活性
RNase H 能夠從 RNA-DNA 雙鏈中降解 RNA 鏈，從而允許雙鏈 DNA 的有效合成。然而，當使用長 mRNA 作為模板， RNA 可能被過早的降解，從而導致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆過程中，如果需要合成長的轉錄物時，盡量減小 RNase H 的活性通常是有益的。與此相反，擁有 RNase H 活性的逆轉錄酶通常有利于 qPCR 的應用，因為它們能夠在 PCR 的第一個循環中提高 RNA-DNA 雙鏈的熔解（圖3）。
圖 3.逆轉錄酶中 RNase H 活性。
在 qPCR 中，使用具有 RNA 酶活性的逆轉錄酶。
RT-qPCR 的 qPCR 過程
引物設計
用于 RT-qPCR 中 qPCR 步驟的 PCR 引物最好應設計成跨越一個外顯子-外顯子連接，其中一條擴增引物可以潛在地跨越實 際外顯子-內含子邊界（圖4）。由于含內含子的基因組 DNA 序列不會被擴增，因此這種設計可以減少從污染的基因組DNA 中擴增得到的假陽性的風險。 如果引物不能被設計成能夠分離外顯子或外顯子-外顯子邊界，則有必要利用無 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶處理 RNA 樣品以除去基因組 DNA 污染。 RT-qPCR 對照 一個逆轉錄陰性對照（-RT對照）應該包括在所有的 RT-qPCR 的實驗中，以檢測 DNA 污染（如基因組 DNA 或來自之前反 應的 PCR 產物）。這一對照包含除逆轉錄酶之外的所有反應組分。由于該對照不會發生逆轉錄，因此如果觀察到 PCR 擴 增，則極有可能來自 DNA 的污染。
圖 4.RT-qPCR 中 qPCR 步驟的引物設計。
1）如果一個引物被設計為跨越外顯子-內含子邊界，則可能造成污染的基因組 DNA 將不會被擴增，其原因是引物不能退火至該基因組 DNA 模板。相反，cDNA 不含任何內含子，能夠有效被引物識別并 擴增。
2）當引物側接一個長的內含子（例如1 kb），擴增反應將不會發生，因為短的延伸時間僅夠用于擴增短的 cDNA， 卻不足以擴增基因組靶基因。
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