鍍銀染色指把固定后 的組織或切片浸于銀溶液中,再用還原劑處 理,使銀顆粒沉著于軸索的軸漿中,使之呈 現(xiàn)深棕色或黑 色,是神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的主 要染色法。
鍍銀后可在神經(jīng)元胞漿內(nèi)看到許多交錯成網(wǎng)的細(xì)絲,并伸入樹突及軸突之中,這在HE染色中是看不到的。某些疾病時,神 經(jīng)元纖維集結(jié).可用鍍銀染色清晰地顯示。
鍍銀法染色方法
(1)清洗玻片 選擇光滑無裂痕的玻片,最好選用新的。為了避免玻片相互重疊,應(yīng)將玻片插在專用金屬架上,然后將玻片 置洗衣粉過濾液中(洗衣粉煮沸后用濾紙過濾,以除去粗顆粒),煮沸20min。取出稍冷后用自來水沖洗、晾干,再放入濃 洗液中浸泡5—6天,使用前取出玻片,用自來水沖去殘酸,再用蒸餾水洗。將水瀝干后,放入95%乙醇中脫水。
(2)菌液的制備及制片:菌齡較老的細(xì)菌容易失落鞭毛,所以在染色前應(yīng)將待染細(xì)菌在新配制的半固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng) 基斜面上(培養(yǎng)基表面濕潤,斜面基部含有冷凝水)。用消過毒的蓋玻片切取培養(yǎng)基邊緣的小塊瓊脂放進(jìn)試管中,注意要輕 放并輕輕搖動,將該試管放在37℃恒溫箱中靜置10min(放置時間不宜太長,否則鞭毛會脫落),讓幼齡菌的鞭毛松展開。 然后,吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端,立即將玻片傾斜,使菌液緩慢地流向另一端,用吸水紙吸去多余的菌液。涂片放 空氣中自然干燥。要注意的是菌液的含菌數(shù)量一定要少!
干燥后的處理
(1)干燥后用稀鹽酸或稀氫氧花鈉滴,并立即傾斜玻片,使酸(堿)液流下,并自然干燥.
(2)用沖稀的頭發(fā)頂型劑滴加,處理一到三分鐘(具體的要實驗才能知道),并自然干燥. 用于鞭毛染色的菌體是用半固體培養(yǎng)基才用支點法培養(yǎng)的。方法是將0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養(yǎng)基熔化后倒入無菌平皿中,在 培養(yǎng)皿中間放三塊成分減半(但是NaCl不減半,瓊脂為正常百分比)的,恒溫培養(yǎng)12-24h后,取擴(kuò)散菌落的邊緣制作涂片。
(3)染色 ①滴加A液,染4—6min。 ②用蒸餾水充分洗凈A液。 ③用B液沖去殘水,再加B液于玻片上,在酒精燈火焰上加熱至冒氣,約維持0.5—1min(加熱時應(yīng)隨時補(bǔ)充蒸發(fā)掉的染料, 不可使玻片出現(xiàn)干涸區(qū))。 ④用蒸餾水洗,自然干燥。
(4)鏡檢:先低倍,再高倍,最后用油鏡檢查。 結(jié)果:菌體呈深褐色,鞭毛呈淺褐色。
注意事項:
1.要選好菌種。一般用周生鞭毛菌(如普通變形桿菌Proteus vulgaris)較好,這類菌的鞭毛多而長易于觀察。
2.要注意培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間: ①用點接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固體平板上接種。一般一個平板點接3~4處。經(jīng)比較用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出來的菌體 活動度大,鞭毛長且多,易于染色,這可能與半固體培養(yǎng)基更適于菌體運(yùn)動、鞭毛生長較好有關(guān)。用點接種法在平板上接種 更易于挑取邊緣幼齡的菌體。 ②培養(yǎng)時間要嚴(yán)格掌握,一般培養(yǎng)9~12h較好,菌齡超過15h,鞭毛染色效果較差,這可能與老齡菌體活動度降低、鞭毛易 脫落有關(guān)。冰箱長期保存的菌種不宜直接用于鞭毛染色,需用新制備的斜面連續(xù)轉(zhuǎn)接2~3次后再染色。
3.所用玻片的準(zhǔn)備:
①用過的舊載片要選擇光滑無劃痕的,放入已加入洗衣粉的蒸餾水中煮沸(如能預(yù)先過濾去渣更好),煮畢冷卻后,清水洗 凈,放入濃洗液中浸泡24h,取出用清水沖洗殘酸,最后用蒸餾水洗凈,瀝干水并放于95%乙醇中脫水,取出后燒去酒精, 即可使用。
②新的載片雖沒有油污、劃痕,但含游離堿較多,所以要用2%鹽酸浸泡幾小時,用自來水沖洗干凈,然后再用蒸餾水洗 凈,瀝干后再用效果較好。
4.染色液一定要新鮮,特別是硝酸銀染色法中更是如此,A染液和B染液最好都現(xiàn)用現(xiàn)配,A液一般不能放置。
5.染色過程中的細(xì)節(jié)也應(yīng)充分注意:
①取菌要取菌落邊緣的幼齡菌體。
②取菌后的接種環(huán)在載片上的蒸餾水中輕輕沾幾下即可,不要用力太猛,更不能用接種環(huán)大幅度涂開;將載片稍傾斜,使菌 液散開即可,否則鞭毛易脫落,造成染色失敗。
③鞭毛染色的玻片只能自然干燥,不能用熱風(fēng)吹干,不能熱固定,這是由于加熱后菌體易變形,鞭毛易脫落,影響觀察。
④A染液染3~5min,其后用蒸餾水(自來水效果差)沖洗時一定要充分,否則加B染液后,背景很臟,鞭毛不易被觀察到, 影響實驗效果。
⑤加B染液后,將玻片稍加熱(但不能太熱,更不能沸騰或蒸干)使其微冒蒸汽,30~60s,染色效果較不加熱為好。
⑥B染液染完后,用蒸餾水沖洗比用自來水沖洗效果好
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